Герасименко Ганна

молодший науковий співробітник

Інстітут біоенергетичних культур і

цукрових буряків НААН України

м.Київ

АНДРОГЕННІ КАЛУСИ ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ В КУЛЬТУРІ IN VITRO

Впровадження в селекційні програми сучасних біотехнологічних методів і прийомів, особливо в поєднанні з традиційними методами селекції, дозволяє створити новий вихідний матеріал такої важливої технічної та біоенергетичної культури, як цукрові буряки, з необхідним комплексом господарсько-цінних ознак в значно коротші терміни. Одним з таких перспективних методів біотехнології рослин є метод експериментального андрогенезу (отримання гаплоїдів в культурі пиляків). А як відомо, отримання морфогенних калусів в культурі in vitro є ключовим етапом непрямого андрогенезу.

Досліди проводили в лабораторії біотехнології ІБКіЦБ в 2012 – 2015р.  В дослідженнях використовували селекційний матеріал Білоцерківської та Ялтушківської дослідно-селекційних станцій ді- і тетраплоїдні запилювачі цукрових буряків, сорти-популяції, які вирощували в умовах поля та в кліматичних камерах ІБКіЦБ. В період бутонізації – цвітіння насінників відбирали пагони з бутонами, з яких отримували експланти – пиляки. Cтебла з бутонами насінників цукрових буряків були піддані холодовій передобробці у холодильній камері за температури 6-10⁰С, при 16-годинному освітленні 1,0-2,0 клк. упродовж 7-30 діб.

Для кожного етапу культивування, а саме ініціації процесів калусогенезу, культивування отриманих калусів, стимуляції процесів морфогенезу, було розроблено серії живильних середовищ з різним вмістом макро- та мікроелементів. Модифікація середовищ відбувалась додаванням до базового середовища або зміною кількості діючої речовини певної групи, а саме амінокислот, регуляторів росту, вітамінів, цукру, а також їх сумішей. За базову використали мінеральну частину середовища Мурасиге-Скуга із зменшеною у 2 рази кількістю макроелементів, додаванням вітамінів згідно пропису Уайта, 15,0-100,0г/л сахарози або мальтози, регуляторів росту: 2,4-Д – 1,0-2,0мг/л, 6-БАП – 0,2-1,0мг/л, ІОК– 0.2-0,5мг/л, НОК– 0,5-1,0мг/л, ГК– 0,2-0,5мг/л, АВК– 0,03-0,3мг/л, а також суміши амінокислот, що включала глютамін – 12,5-500,0мг/л, аспарагінову кислоту – 30,0-50,0мг/л, аргінін – 2,0-250,0мг/л , а також пролін, гідроксіпролін, тирозин, гліцин у дозах 2,0-5,0мг/л.

У залежності від етапу культивування отримані калуси було умовно поділено на первинні, вторинні і третинні. Спостереження показали, що отримані первинні калуси, проліферація яких проходила з різних структур (з поверхні пиляка, з пилку, із залишків тичинкової нитки ), були білого кольору або безкольорові та напівпрозорі, пухкі або тверді, тобто мали різну консистенцію, але гомогенну структуру. Після перенесення колб із калусами в умови культуральної кімнати з освітленням на протязі 18 годин, первинні калуси збільшувались у розмірах, деякі набували жовтуватого або зеленуватого забарвлення.

Через певний проміжок часу (1-3 тижні) для забезпечення подальшого росту і розвитку, калуси пересаджували на серії живильних середовищ з іншим вмістом і кількістю регуляторів росту. Зокрема, використовували середовища з переважною кількістю цитокінінів порівняно з ауксинами, або з повною відсутністю ауксинів. Це дозволило отримати вторинні калуси, які відрізнялися від попередніх (первинних) калусів за кольором (білі, зелені, коричневі, різнокольорові), поверхневою структурою (бугорчата, зерниста, вузловата, гладка), гомо- чи гетерогенністю структури, вмістом хлорофілу. Для цих було характерна наявність меристематичних центрів, формування морфогенних меристем та подальший органогенез відбувався при пасивуванні калусів на інщі модифіковані середовища до отримання морфогенних калусів, у яких мерістематичні центри набували подальшого розвитку, започатковували первинні коренці, бруньки, листоподібні утворення.

В наших дослідженнях були отримані як короткоживучі, так і довгоживучі калуси. Короткоживучі – гетерогенні за зовнішнім виглядом, гістологічною структурою та здатністю до регенерації. Було виявлено, що окремі ділянки короткоживучого калусу здатні продукувати довгоживучі калуси, які характеризувалися морфологічним різноманіттям і гістологічною гетерогенністю ділянок, серед яких відмічено утворення меристематичних зон. Для отримання колоній довгоживучих калусів на короткоживучому калусі знаходили та ізолювали специфічні сектори свіжої тканини, здатні до швидкого росту, переносили їх на модифіковані середовища та продовжували подальше культивування. Отримані колонії довгоживучих калусів різнілись за розмірами, консистенцією, кольором. При пасивуванні на живильні середовища з різним гормональним складом вони виявляли морфогенну активність.У них відбувався гемо- та ризогенез як і у їх попередників – короткоживучих калусів. Таким чином, було отримано, відібрано і розмножено колонії андрогенних калусів, ростову та морфогенну активність яких підтримували протягом року на модифікованих живильних середовищах.