Пушкарьова Надія

інженер

Белокурова Валерія

старший науковий співробітник

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

м. Київ

особливості ВВЕДЕННЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ДЕЯКИХ РІДКІСНИХ ТА ЗНИКАЮЧИХ ВИДІВ ФЛОРИ УКРАЇНИ

Збереження біологічного різноманіття є важливою проблемою сучасності. Погіршення екологічних умов існування людства, виснаження природних ресурсів, зумовлюють занепокоєність проблемою скорочення біорізноманіття у всьому світі та в Україні зокрема. Про це свідчить прийнята на Генеральній асамблеї Міжнародного союзу біологічних наук за підтримки ЮНЕСКО Міжнародна програма "DIVERSITAS" та Конвенція про біорізноманіття, ратифікована Україною у 1994 році. На основі останньої була підготовлена Загальнодержавна програма збереження біорізноманіття України на 2007 – 2025 роки [1].

Використання методів біотехнології може зробити значний внесок у збереження біологічного різноманіття рослин, зокрема для таких видів, що знаходяться на межі зникнення та з тих чи інших причин не зможуть відновити свою чисельність без стороннього втручання [2]. Початковим етапом проведення біотехнологічних робіт по збереженню та культивуванню рідкісних та зникаючих видів рослин є етап введення рослин в культуру in vitro. В якості вихідного матеріалу було використано насіння ряду видів дикорослої флори України, які належать до різних таксономічних груп, мають різний природо-охоронний статус та занесені до Червоної книги: Iris sibirica L., Pinus cembra L., Lonicera caerulea L., Crambe tataria Sebeόk var. pinnatifida (W.T.Aiton), Saussurea discolor (Willd.) DC., Ligularia sibirica (L.) Cass, Glaucium flavum Crantz [3].

При роботі з рослинами, що занесені до Червоної книги України чи є об’єктами територіальної охорони, отримати достатню кількість вихідного насіння часто буває досить важко, nому важливим є відпрацювання оптимального способу стерилізації насінин, що дозволив би отримати надійні результати при використанні невеликої кількості вихідних експлантів [4].

Підготовку експлантів та введення їх в культуру in vitro проводили в асептичних умовах згідно із загальноприйнятими рекомендаціями [5]. Вивчали вплив різних стерилізуючих сполук: «Білизна» (при експозиції 4 - 12 хв), діацид (час експозиції 1 - 6 хв), 3% Н₂О₂ (час експозиції 4 - 12 хв) та 15% Н₂О₂ (час експозиції 1-6 хв). Після проведення поверхневої стерилізації насіння переносили в чашки Петрі на агаризоване живильне середовище Мурасіге-Скуга (MS) [6] та інкубували на живильному середовищі при температурі +24°С та 16–годинному фотоперіоді.

Для кожної групи насіння було визначено відсоток асептичного насіння по відношенню до загального числа вихідних експлантів (ефективність стерилізації), та відсоток  насіння, яке після обробки стерилізуючими сполуками утворювало проростки (ефективність проростання).  

Було визначено, що найкращий результат стерилізації вдалося досягти з використанням діациду при експозиції протягом 3 хвилин. Ефективність стерилізації в цьому випадку становила 96%, а ефективність проростання - 53%. При використанні інших стерилізуючи сполук показники асептичності насіння були значно нижчі (для «Білизни» - 63%, для 15% Н₂О₂  - 65%, для 3% Н₂О₂ - 62,5%), відсоток асептичного насіння, що утворило паростки, був дуже низьким (для «Білизни» - 1%, для 15%Н₂О₂   - життєздатні паростки не утворювались, для 3%Н₂О₂  - 2%). Найкращі показники виживаності насіння ми отримали при стерилізації насіння Iris sibirica L. – 50% («Білизна»), 80% (діацид), 13% (3% Н₂О₂). Ефективність стерилізації при цьому становила - 33% («Білизна»), 83% (діацид), 60% (3% Н₂О₂). Найнижчі показники виживаності насіння спостерігались при стерилізації насіння Pinus cembra L. – 33% при використанні діациду, за використання інших стерилізуючи сполук паростки не були отримані взагалі. Ефективність стерилізації при цьому становила 83% («Білизни»), 100% (діацид), 90% (3% Н₂О₂), 100% 3% Н₂О₂ ).

Таким чином, на прикладі рослин різних таксономічних груп підтверджено, що вибір хімічного агенту для поверхневої стерилізації насіння є важливим фактором успіху роботи по індукції асептичної культури, який впливає не тільки на ефективність стерилізації, але і на проростання та формування життєздатних рослин для подальшого розмноження в культурі in vitro. Це особливо важливо при роботі з видами рослин, наявність насіннєвого матеріалу яких обмежена.

Література

1. Биотическое разнообразие: его изучение, сохранение и обогащение / К.М. Сытник // Альгология. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 368-382.
2. Белокурова В.Б. "Методи біотехнології в системі заходів зі збереження біорізноманіття рослин". Цитология и генетика, 2010, т. 44, № 3, 58-72
3. Червона книга України. Рослинний світ/ за ред. Я.П. Дідуха — К.: Глобалконсалтинг, 2009.– 900 с.
4. Sarasan W., Cripps R., Ramsay M.M., Atherton C.,McMichen M., Prandergast G., Rowntree J.K. Conservation in vitro of threatened plants – progress in the past decade // In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant. – 2006. – 42. – P. 206–214.
5. Мікроклональне розмноження рослин. Теорія і практика/ Г.П. Кушнір, В.В. Сарнацька – К.: Наукова думка, 2005. – 269 с.
6. Murashige T.,  Skoog F. "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures". Physiol. Plant., 1962, v.15, p. 473-497.