Заяць Анастасія

слухач магістратури

Науковий керівник: к.т.н., доцент Антонюк М.М.

Національний університет харчових технологій

м. Київ

СТВОРЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ ФІТОПАТОГЕННИХ БАКТЕРІЙ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ЦІЛЬОВИХ БІЛКІВ

Серйозною проблемою біотехнології є отримання нетоксичних біоактивних поліпептидів. Використання живих вірулентно-атенуйованих бактерій (у випадку вакцин) або гетерологічних білків з таких бактерій обмежена, гостро стоїть питання підвищення безпеки подібних білків терапевтичної дії [1]. Для вирішення цієї проблеми є можливість застосовування фітопатогенних грамнегативних бактерій, які у структурі клітинної стінки містять систему секреції третього типу (ССТТ), проте не несуть шкоди для людини, у порівнянні з патогенними і/або умовно-патогенними бактеріями,  при цьому не потребуючи атенуювання.

Для створення ефективної системи секреції гетерологічних білків за допомогою ССТТ необхідно підібрати і сформулювати такі генетичні структури: 1) промотор, що дозволяє експресувати білки при наявності апарату ССТТ; 2) сигнальну послідовність з гена субстрату ССТТ, для направлення білка на секрецію; 3) ген або ділянку гена цільового білка  [2].

Найбільш широко використовуваною та ефективною для експорту білка через ССТТ є стратегія конструювання оперону, що містить ген цільового білка, злитий з N-кінцем ефектора білка і його спорідненими шаперонами. Після чого, для можливості експортувати гетерологічний білок, злитий ген клонують в вектор експресії.

На Рис. 1. показана стратегія секреції рекомбінантного білка за допомогою ССТТ. Конструювання гена, який включає ділянки: промотор, шаперон, оператор, ефектор та цільовий ген секретуючого білка. Сконструйований ген можливо клонувати та експресувати у плазміду фітопатогенних бактерій для експорту цільового білка.

Рис. 1. Стратегія секреції рекомбінантного білка за допомогою ССТТ.

Злиття 5' нетрансльованої ділянки білка флагеліну FliC було достатньо для експорту кількох злитих білків (до 424 амінокислот в довжину) в позаклітинне культуральне середовище за допомогою ССТТ [3]. Так було синтезовано 1-15 мг/л позаклітинних білків.

Для експорту цільового білка з найвищою ефективністю, активують ССТТ підбираючи оптимальні умови культивування, такі як температура, рН, аерація, осмотичний тиск або зниження концентрації іонів кальцію в середовищі росту. Ці параметри або регулюють секрецію безпосередньо або через генетичний механізм.

Отже, сучасні методи молекулярної біотехнології дозволяють отримувати не токсичні білки терапевтичної дії за допомогою фітопатогенних бактерій, використовуючи при цьому їх систему секреції третього типу. Також перевагою є те, що ССТТ дозволяє виводити рекомбінантні гетерологічні білки у культуральне середовище, що значно полегшує процес виділення.

Література

1. Hong S. H. et al. Recombinant protein secretion via the type III secretion system //Korean Journal of Chemical Engineering. – 2011. – Т. 28. – №. 7. – Р. 1573-1579.
2. Титова А. Д., Кудин К. В., Прокулевич В. А. Рекомбинантные вакцины на основе системы секреции третьего типа у бактерий рода Salmonella // Труды БГУ. – 2015. – Т. 10. – №1. – С. 133-138.
3. Wilson R. K. et al. Role of EscF, a putative needle complex protein, in the type III protein translocation system of enteropathogenic Escherichia coli //Cellular microbiology. – 2001. – Т. 3. – №. 11. – Р. 753-762.