Гураль Світлана

провідний фахівець

Камінська Марта

к.с-г.н., старший науковий спіробітник

Стефанишин Ольга

к.біол.н., с.н.с., завідувач лабораторії

Інститут біології тварин НААН

м. Львів

ІНДУКЦІЯ БІОСИНТЕЗУ КАРОТИНОЇДІВ У КЛІТИНАХ ДРІЖДЖІВ PHAFFIA RHODOZYMA ЗА ДІЇ ІОНІВ Cu²⁺, Cd²⁺

Мікроорганізми, продуценти каротиноїдів, продовжують цікавити багатьох дослідників у різних фундаментальних та практичних аспектах. Штами дріжджів Phaffia rhodozyma вперше були виділені із сокових виділень пошкоджених дерев у високогірних районах Японії [1] і характеризуються різним рівнем синтезу астаксантину (40-80%) у загальному пулі каротиноїдів. Зусилля науковців останніх десятиліть скеровані на пошук нових [2] та поліпшення виділених ізолятів за ознакою астаксантиногенезу. Тимчасова ефективність мутагену [3] чи селективного агенту [4] помічена лише у перших кількох циклах мутацій, оскільки не вдавалося виявити відмінності між мутантами упродовж наступних мутацій. Крім того, мутанти каротиносинтезуючих дріжджів характеризуються здатністю до штамоспецифічності [5]. Можливо, спроби отримання кращих мутантів невдалі, оскільки відсутня більш чутлива селективна процедура скринінгу. Метою даної роботи став пошук нових схем скринінгу селекціонованих штамів дріжджів P. rhodozyma – надсинтетиків каротиноїдів.

Дріжджі P. rhodozyma культивували у рідкому середовищі складу (г/л): КН₂РО₄ – 1; MgSO₄x7H₂O – 0,5; (NH₄)₂SO₄ – 0,9; CaCl₂x2H₂O – 0,1; дріжджовий екстракт – 2; глюкоза – 20; біотин – 2х 10^-6. За необхідністю у рідке середовище додавали 20 г/л агару. Біомасу дріжджів нарощували в колбах Ерленмейера (заповнення колб 10 %) на шейкері (200 об/хв) за температури 20 °С. Інокулятом була дводобова культура дріжджів, вирощених у рідкому середовищі сталого складу. Свіжоприготовлені водні розчини сульфатів Купруму і Кадмію вносили до середовища після автоклавування з розрахунку до кінцевих концентрацій – 10 мМ Cu²⁺, 15 мМ Cu²⁺ і 20 мМ Cu²⁺ та 42 мкМ, 84 мкМ та 105 мкМ Cd²⁺.

Приріст біомаси дріжджів визначали турбідиметрично на КФК-3 (λ =580 нм, кювета 5мм), а вміст каротиноїдів у біомасі дріжджів за методом Sedmak J. J. [6], тоді як продуктивність культур – за приростом біомаси та вмістом каротиноїдів у клітинах впродовж певного часу культивування.

Внаслідок опромінення ультрафіолетовими променями клітин дикого штаму дріжджів P. rhodozyma NRRL Y – 17268 отримано мутант 8UV з інтенсивнішою пігментацією клітин і цей штам обрано для проведення ступінчастої позитивної селекції [7]. Тому, здійснено пошук концентрацій солей важких металів Купруму та Кадмію як селективних агентів на агарі та досліджено їх вплив на ріст штаму 8UV у рідкій культурі.

В обох випадках за дії досліджуваних концентрацій іонів Cu²⁺ та Cd²⁺ у твердому середовищі спостерігається дозозалежне пригнічення росту клітин. Концентрація іонів Cu²⁺ 20 мМ затримує та пригнічує ріст штаму 8UV дріжджів P. rhodozyma на середовищі з агаром, але посилюється каротиногенез у рідкому середовищі, тому саме таку концентрацію обрано селективним фактором. Досліджувані концентрації сульфату Кадмію виявилися низькими, щоб бути селективними.

Клітини дріжджів, вирощених на агарі з іонами Cu²⁺ та Cd²⁺  відповідно за різних концентрацій, пересіяно у рідке середовище без додаткового внесення цих іонів, щоб перевірити рівень синтезу каротиноїдів та продуктивність штаму. Отримані результати показують, що попереднє культивування штаму 8UV  на агарі з іонами Cu²⁺ за концентрацій 10 мМ та 20 мМ посилює каротиногенез при наступному культивуванні у рідкій культурі на 5, 3 % та 7,9 %, а приріст біомаси знижується на 8 % та 8,9 % порівняно з контролем штаму без попереднього навантаження іонами Cu²⁺. Цікаво, що проміжна досліджувана концентрація 15 мМ сульфату Купруму пригнічує біосинтез каротиноїдів у штаму 8UV  на 5,3 %, в той час як біомаса зростає на 8,2 %.

Вплив іонів Cd²⁺  вказує на однозначний дозозалежний токсичний ефект на клітини штаму, оскільки пригнічується каротиногенез та приріст біомаси. Так, за резистентності до концентрації 105 мкМ сульфату Кадмію знижується рівень синтезу каротиноїдів на 7,9 %. За вмістом каротиноїдів у культурі цей показник знаходиться на рівні контролю за попереднього культивування клітин на твердому середовищі у присутності 84 мкМ іонів Cd²⁺. Удвічі нижча концентрація 42 мкМ Cd²⁺ збільшує на 8,7 % вміст каротиноїдів у культурі за рахунок посилення приросту клітин на  5,9 % та незначного (2,6 %) посилення біосинтезу каротиноїдів порівняно до показника у інтактних клітин. Таким чином, встановлено, що попередній стрес іонами Cu²⁺, Cd²⁺ на агаризованому середовищі або у маточній культурі може активувати каротиногенез у клітинах дріжджів P. rhodozyma, а основне культивування у рідкій культурі відбувається у середовищі без токсикантів. Тому цей процес можна розглядати як оновлену схему культивування дріжджів Phaffia для індукції біосинтезу каротиноїдів.

Література

1. Phaff H.J., Miller M.W., Yoneyama M., Soneda M. A comparative study of the yeast flora associated with trees on the Japanese Islands and on the west coast of North America. –Soc. Ferment. Technol., Osaka. – 1972. – P. 759-774.
2. Libkind D, Moliné M, Tognetti C. Isolation and selection of new astaxanthin producing strains of Xanthophyllomyces dendrorhous. – Methods Mol. Biol. – 2012. – Vol. 898. – P. 183-94.
3. Камінська М. В. Вплив різних доз УФ-опромінення на мутагенез у клітинах дріжджів Phaffia rhodozyma – 2003. – Біологія тварин. – Т. 5, № 1-2. – С. 253-256.
4. Lewis M. J. Selection of astaxanthin-overproducing mutants of Phaffia rhodozyma with beta-ionone / M. J. Lewis, N. Ragot, M. C. Berlant, M. Miranda // Appl. Environ. Microbiol. – 1990. – Vol. 56. – P. 2944-2945.
5. Rubinstein L., Altamirano A., Ducrey Santopietro L. Isolation and characterization of Phaffia rhodozyma mutants – Folia Microbiol. – 1998. – Vol. 43, No. 6. – P. 626-630.
6. Sedmak J. J., Werasinghe D. K., Jolly S. O. Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma –  Biotechnology Techniques – 1990. – Vol. 4, No 2. – P. 107-112.
7. Гураль С. В., Колісник Г. В., Климишин Д. О., Гончар М. В. Дослідження складу каротиноїдів у мутантів дріжджів Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) – Біотехнологія. – 2011. – Т. 4, № 1. – С. 93-100.